Diabetologia：激活但功能受损的记忆Tregs在1型糖尿病患者进展缓慢的反复中逐渐扩展

从第一次用到呼吸道自身免疫球蛋白到用到1HG癌症临床数据分析腹泻的进展所部在学龄前时期就有很好的揭示，多个呼吸道自身免疫球蛋白特征性的学龄前里面有70%在人质内转换成后10年底患上癌症，而随访15年的学龄前这一%-缩减到84%。相较之下，占临床数据分析1HG癌症一半以上的HG1HG癌症的肺癌机制还不会取得合理的数据分析。

不够为多的人开始可用分期系统来定义1HG癌症的进展：有机质在用到多种呼吸道自身免疫球蛋白时进入第1收尾，用到血糖异常时进入第2收尾，用到腹泻时进入第3收尾。一些多发呼吸道自身免疫球蛋白特征性的有机质，在1期和2期，进展较太快，并发展为肺癌的1HG癌症。我们之前揭示了一两组在首次检测到多种呼吸道自身免疫球蛋白抽样后至极少10年无癌症的极太快进展者，这两组腹泻人数极少，但相似性非常明确。随后，我们找到呼吸道自身淋巴细胞特异性CD8+T细胞内反不应在进展缓太快的腹泻里面大质上不存在，但在近期肺癌和长年存在的癌症腹泻里面很容易检测到。这可能指出，与进展腹泻相较，这些腹泻自身免疫反不应的平衡减弱。

早期数据分析指出，尽管平衡性T细胞内(Treg)数量正常，但癌症腹泻存在一些功用缺陷，其里面包括对IL-2的反不应能力降低。此外，癌症腹泻里面的效不应CD4+T细胞内可能对平衡不够具抵抗性，表现为效不应T细胞内的抑止减弱，连续性激发的Treg和质外激发的诱导Treg，以及淋巴细胞经历的CD4+T细胞内里面IL-2反不应减弱。本数据分析的目的是揭示了CD4+平衡性T细胞内(Treg)在一小群极缓太快进展者里面的相似性，他们的平均年龄为43岁(31-72岁)，随访短时间为18-32年。

方法：BOX数据分析是一项以人群促使将的斜向数据分析，在21岁以下确诊的腹泻亲属里面检查1HG癌症的危险各种因素。我们之前揭示了长年缓太快进展者的相似性，他们依然多重呼吸道自身免疫球蛋白特征性超过10年，但不会用到癌症的临床数据分析腹泻，太快性或非外阴自身免疫。随后，10名在此期间依然无癌症并愿意缺少大量质内抽样的缓太快进展者设为T和B细胞内功用分析方法。在目前的数据分析里面，8名太快进展者(SP两组)，里面位年龄43岁(31-72岁)，18 - 32岁相互间的呼吸道自身免疫球蛋白特征性。所有的与会者都处于1HG癌症进展的1期，尽管一些人随后夺去了呼吸道自身免疫球蛋白对某些淋巴细胞的特征性反不应，然而，一名腹泻从未处于2期至极少6年，但不会用到临床数据分析腹泻，一名腹泻被确诊为癌症，该测试者72岁，在采集实验者抽样时，其HbA1c急剧下降到53 mmol/mol(7%)，在数据分析方法里面对该遗传物质进行时了实质上评量。分离外周血单个氢细胞内(PBMCs)，采用多参数流式细胞内法术和T细胞内抑止试验评量遗传物质里面Treg的频所部、表HG和功用。可用FlowSOM和CITRUS(聚类检验、表征和回归)进行时无监督聚类分析方法，评量Treg表HG。

结果：与健康遗传物质相较，来自太快进展质的思绪CD4+T细胞内的监督聚类结果显示，抑制的思绪CD4+ Treg频所部缩减，与持续性诱导的TNFR具质蛋白(GITR)表达出来缩减有关。一名HbA1c急剧下降的腹泻与进展缓太快者和匹配的对照两组相较，Treg小曲大同小异。功用分析方法指出，与健康遗传物质相较，来自缓太快进展质的Treg介导的CD4+效不应T细胞内抑止明显受损。表现为对效不应CD4+T细胞内CD25和CD134表达出来的抑止缩减。

示意图1 深入的表HG分析方法结果显示，CD4+Treg亚HG在太快进展数据流里面缩减。由FlowSOM生成的Treg室，聚集在来自所有遗传物质的活CD4+CD45RA -细胞内上。根据记号物表达出来检验出10个元簇:思绪T细胞内_1;思绪T cell_2;思绪T cell_3;思绪T cell_4;CD49b思绪T细胞内;HLA-DR + GITR +思绪T细胞内;寄存器Treg_1;寄存器Treg_2;寄存器Treg_3;和寄存器Treg_4。(a)可用9个不同Treg记号生成的10个元簇的MST。每个路由表都有一个空降兵(100个空降兵)，不够大的元空降兵(10个元空降兵)在路由表两组周围绘示意图。每个路由表里面的点心示意图说明单个记号的表达出来级别。(b)每个元聚类的热示意图，以结果显示适度记号表达出来。(c, d)为HD两组(c)和SP两组(d)生成示意图，以及FlowSOM识别的每个元簇的覆盖层。(e-l)相对轻元素为每个metacluster木箱直通示意图(轻元素> 0.05%)未确定为HD和SP两组:寄存器Treg_2 (e),寄存器Treg_3 (f),寄存器Treg_4 (g), HLA-DR + GITR +思绪T细胞内(h)、思绪T cell_1(i),思绪T cell_2 (j),思绪T cell_3 (k) n d CD49b思绪T细胞内(l)。绿色格子都有理应SP 606。**p< 0.01, Wilcoxon筛选符号秩检验。此键适用于示意图形部分(a)， (c)， (d)和d (e-l)

示意图2 可用CITRUS的预测模HG证实，Treg频所部的缩减是进展缓太快的徽章。分级门控(a - f)和玉米分析方法(g-k)相当SP与会者和匹配的HD与会者在CD4+CD45RA−T细胞内上的差异。(a)互补CD25+ cd127 lotreg和CD25loCD127+T c e l群质的传奇色彩示意图。CD25+ cd127lotreg被CD39和FOXP3富集，然后通过HLA-DR和GITR表达出来进行时分离，模拟FlowSOM群质。(b) HD(黑斑)和SP(布氏)两组以及遗传物质SP 606(绿色)里面CD25+ cd127的频所部汇总示意图。(c-f) CD25+CD127loCD39+FOXP3+和CD25loCD127+门控开集的木箱直通示意图;(c) HLA-DRloGITR−(寄存器Treg_2)， (d) HLA-DRintGITRlo(寄存器Treg_3)， (e) HLA- d RhiGITR+(寄存器Treg_4)， (f) HLA- d RhiGITR+(HLA-DR+GITR+寄存器T cell)。(g - i)柑桔簇螺旋形由(g) CD127， (h) CD25和(i) FOXP3表达出来强度着色，箭头显眼的簇被识别为SP和HD数据流相互间的不同。(j)木箱直通示意图结果显示了在SP(布氏)和HD(灰点)两组里面，CITRUS思绪Treg_3和Treg_4的相对轻元素(%-)。(k)直方示意图结果显示每个簇的表HG(红色)和Treg记号相对表达出来与着重表达出来(粉红色);上列，寄存器Treg_3;下面一行，寄存器Treg_4。着重与所有其他簇里面记号的表达出来有关。*p< 0.05， **p< 0.01, Wilcoxon筛选符号秩检验

示意图3 与健康献血者相较，进展缓太快者思绪treg的GITR缩减。每个思绪CD4+T细胞内元簇(思绪T细胞内_1;思绪T cell_2;思绪T cell_3;CD49b +思绪T细胞内;HLA-DR + GITR +思绪T细胞内;寄存器Treg_2;寄存器Treg_3;来自FlowSOM的memory Treg_4)检测每个表达出来记号的变化。(a,b)来自HD (a)和S (b)数据流的表达出来热示意图(sp606不包括在内)。(c,d)思绪Treg_4元簇里面所有HD(红色)、所有SP(粉红色)和SP 606(绿色)的FlowSOM GITR表达出来串联，结果显示直方示意图(c)和汇总示意图(d)。Wilcoxon筛选符号秩和检验，p< 0.07(绿色)所有遗传物质包括，p< 0.05(粉红色)遗传物质SP 606和匹配的HD不包括在测试里面。(e,f) HLA-DRhiGITR+Tregs里面GITR表达出来，从分级门控，从所有HD(红色)、所有SP(粉红色)和SP 606(绿色)串联，结果显示直方示意图(e)和汇总示意图(f) *p< 0.05, Wilcoxon筛选符号秩检验

示意图4 来自缓太快进展的CD4+ treg细胞内控制效不应CD4+T细胞内的能力降低。SP两组用粉红色的直通和格子说明，HD两组用黑色的直通和格子说明，绿色的直通/格子说明遗传物质sp606。可用CD4+CD25+ Treg分选试剂盒对CD4+T细胞内进行时分选。CD4+CD25−(不此番者)被记号为CFSE, Treg按观察的%-滴定。用抗CD3 /28微珠活化细胞内，人才培养3天后进行时流式细胞内法术检测。(a-d)与CD4+不此番者相对不应的treg人才培养(其会)(e-h) HD、SP或SP 606 Treg与HD不此番者人才培养。(a,b,f) CFSE增殖(a,e)和CFSE抑止平均值(b,f)。(c, d,h) CD25 (c,g)和CD134 (d,h)的抑止平均值。可用特征性对照(抑制的响不应细胞内不含treg)计算抑止平均值。*p< 0.05， **p< 0.01， ***p< 0.001，重复测量双向方差分析方法。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重相当测试

示意图5 效不应CD4+T细胞内对缓太快进展的T细胞内活化的抑止不够敏感。SP两组用粉红色的直通和格子说明，HD两组用黑色的直通和格子说明，绿色的直通/格子说明遗传物质sp606。可用CD4+CD25+Treg分选试剂盒对CD4+T细胞内进行时分选。CD4+CD25−(不此番者)被cfsel记号，treg按观察的%-滴定。用抗CD3 /28微珠活化细胞内，人才培养3天后进行时流式细胞内法术(CD25反染)和细胞内因子分析方法。HD Treg与HD、SP或sp606不此番者主导人才培养。(a,b) CFSE增殖(a)和CFSE抑止%-(b)。(c,d) CD25抑止%-(c)和CD134抑止%-(d)。(e,f) IFN-γ(e)和IL-17A (f)在共人才培养里面的表达出来。***p< 0.001， **p< 0.01，重复测量双向方差分析方法。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重相当测试

结论：我们计算出来的结论是，来自缓太快进展子的活化思绪CD4+Treg在GITR表达出来里面取得了适配和多样，强调了促使数据分析Treg在1HG癌症风险有机质里面的异质性的必要性。

文里面中有：

Boldison J, Long AE, Aitken RJ,et al.Activated but functionally impaired memory Tregs are expanded in slow progressors to type 1 diabetes.Diabetologia 2021 Oct 28